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温和且灵活地自动化培养哺乳动物贴壁细胞

更新时间:2024-12-23浏览:495次

实现本应用自动化的三大理由

哺乳动物体外细胞培养物的可用性是药物发现的一个关键瓶颈。为了将哺乳动物细胞作为基于细胞的高通量测试的资源,必须克服人工细胞繁殖缺乏标准化、重复性差和通量不足的问题。

• 提供大量培养细胞。

• 确保可重复性和过程安全性。

• 标准化哺乳动物细胞增殖。

 

简介

在药物筛选和细胞生物学研究中对哺乳动物细胞的需求不断增加。在高通量筛选中,候选药物的评估基于其对细胞培养的生物效应,在基于细胞的ADME-T测定中测试新化合物的代谢行为和毒性。基础研究依赖于大量的细胞系和原代细胞,它们构成了阐明细胞增殖、分化和功能的基本机制的工具。在这个领域,胚胎干细胞作为一个模型系统越来越重要。这些细胞除了具有巨大的分化潜能外,还具有无限自我更新的能力,这有助于它们进行有效的基因修饰。目前使用的细胞培养方法的局限性包括缺乏标准化与重复性差和通量不足。由此可见,细胞的可用性会成为实验全流程的瓶颈。HAMILTON和Life&Brain结合了他们在原代细胞、细胞系和胚胎干细胞自动培养系统开发方面的专业知识,该系统可大量提供高质量的细胞。

方法描述

该系统的典型流程包括:

• 预定运行期间细胞培养板中培养基的更换

• 胰蛋白酶化后细胞培养物的收集

• 在培养孔内均匀地接种细胞

• 向细胞培养物中添加生长因子或药理活性物质

通常培养基更换在隔夜运行中进行,如下所示:

• 通过工作列表选择感兴趣的微孔板

• 计算容器中的适量培养基,并从冷培养箱中获取;然后将培养基容器转移至加热位置

• 将第一个板从温培养箱转移到移液工作站,并去除残留的培养基

• 使用一次性吸头或可洗钢针更换培养基

• 将微孔板转移回培养箱中

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手动温和处理 - 转移至自动化流程

Hamilton的液体处理技术可以模拟典型的手动操作,例如板混匀或温和移液。本品非常适合处理脆弱的哺乳动物贴壁细胞,如胚胎干细胞。

技术

Hamilton“无管” 技术: Hamilton 监测空气置换(MAD)移液技术消除了管、泵或系统液体的使用,从而显著降低了细菌生长造成污染的风险。

接种

这采用Cellhost系统接种可使小鼠胚胎干细胞均匀分布在饲养细胞层上。在胚胎干细胞的情况下,细胞的均匀分布尤为重要,因为细胞团块的形成导致不受控制的分化。为了达到这一结果,用机械手模拟在微孔板上分配细胞的典型手动动作。套系统主要由8通道的Microlab   STARlet液体处理工作站构成,手动装载吸头、试剂、滤膜板和PCR板的载架,真空抽滤系统整合在工作站的台面上。在操作过程中,通过CO-RE抓手来移动微孔板、装载及拆卸抽滤板架。

培养基更换

细胞培养中最常见的流程是培养基的更换。为了最大限度地减少残留量,在一侧升高细胞培养板(图2),并在孔的底端小心吸出培养基。在孔边缘缓慢加入新培养基,从而避免干扰细胞层。显微镜研究显示细胞层的完整性(图3a)-与不太谨慎的手动实验形成鲜明对比(图3b)。

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系统描述

Cellhost系统的核心是配备内部机械手iSWAP的Microlab STAR移液工作站。其在平台上处理SBS标准细胞培养板。两个Kendro培养箱整合到系统中(图1)。系统的模块化架构允许将附加组件整合到台面上,例如成像系统。

应用软件

该系统由标准PC和Hamilton开放灵活的Microlab Venus软件控制,用于过程控制和第三方组件整合。任何设计用于处理大量板的自动化系统,每个板都经历复杂的操作且需具备数据跟踪能力。Hamilton Celltask软件可轻松安排重复过程,使细胞培养自动化操作非常简便(图4)。Celltrack软件监测并跟踪每个板上的每个操作,并根据CFR 21第11部分的要求进行数据文件记录。

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系统的生物验证

根据GLP,使用胚胎干细胞(最敏感的细胞培养范例之一)验证了Cellhost系统。已经明确验证了生物可行性:

•  移液(接种、收集)后细胞的活力

•  更换培养基后细胞层完整

•  接种后细胞在孔中的均匀分布

•  使用可清洗钢针时无交叉污染

结果

用Cellhost培养的胚胎干细胞在接种和更换培养基后保留其典型形态(图5)。自发分化的程度不超过在人工处理的培养物中观察到的程度。通过碱性磷酸酶活性的组织化学检测来验证多能状态的维持。培养48小时后的细胞活力与手动对照实验中测定的相当。未检出污染。

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通量和容量

6孔板2ml培养基的处理时间:

•  培养基更换:340s

•  细胞收集:1500s

•  滋养细胞制备:520s

•  胚胎干细胞(ESC)板的制备:940s

•  细胞培养箱可扩展至容纳1000个96孔板

讨论

这项研究的结果表明了胚胎干细胞培养自动化的可行性。此处使用的系统优点是基于手动方法并且不需要液体补充模块。细胞在各种移液步骤中容易存活,如机械接种和反复更换培养基。显微镜观察显示,胚胎干细胞的典型形态得以保留。此外,与手动对照相比,未观察到自发分化增加-这明确表明Cellhost温和处理细胞。该系统以无污染的方式运行。可以预期,为胚胎干细胞精细培养而开发的过程可以转化为毒理学试验和药物筛选中常用的不太敏感的细胞类型。为进一步自动化细胞系(如CaCo2)和下游应用(如报告基因分析)扫清了道路。随着细胞培养的自动化,制药和生物技术公司的人工工作量大大减少。

 

 

 

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