基于WGS的新生儿重症监护室罕见病快速诊断文库制备自动化

简介

迪拜Al Jalila儿童专科医院的基因组学中心（CoE）利用Hamilton液体处理工作站的自动化功能，为新生儿重症监护室的儿童提供基于全基因组测序（rWGS）的快速检测。这个名为“小猎鹰"的项目将对200名儿童及其父母进行测序，目的是证明这种方法在这种医疗环境中诊断速度和患者整体护理方面的实用性。本案例研究描述了基因组学CoE如何通过使用Hamilton液体处理工作站，实现自动化rWGS文库制备流程，从而提高准确性、可重复性、无人值守时间、通量和灵活性。

关于Al Jalila儿童专科医院

Al Jalila儿童专科医院（AJCH）于2016年11月1日落成，是阿拉伯联合酋国家儿童专科医院。AJCH共有1000多名员工，包括医生、护士、专家和临床支持人员，分为六个CoE，每个CoE都有自己的专长：肾脏、神经科学、心脏、儿童和青少年心理健康、重症监护和基因组学。

Al Jalila儿童专科医院的基因诊断技术在AJCH的新生儿重症监护室，基因组学CoE发挥着至关重要的作用，为各种儿科疾病和综合征提供早期诊断测试。这些疾病包括与听力损失、肠胃病学、肺病、骨骼和结缔组织、内分泌学、免疫学和风湿病学有关的疾病。

基因组学实验室利用下一代测序技术（NGS）、如全外显子测序（WES）、全基因组测序（WGS）、以及芯片（染色体芯片）、液滴数字PCR (ddPCR) 和Sanger测序等先进技术，提供定制的精准基因检测服务。

2022年，基因组学CoE开发了一个名为“小猎鹰"的项目，旨在两年内为200个家庭提供基于rWGS的检测（共600个个体的三重分析）。为了实现这一目标，基因组学CoE依靠12名专业员工，包括一名美国委员会认证的临床分子遗传学家、生物信息学科学家、基因组分析师、分子技术专家和遗传顾问。

基因诊断自动化

起初，基因组学CoE以人工方式进行所有检测。然而，随着该公司开始成为中东地区较大的基因检测平台，提高通量和可重复性成为当务之急。

Tayoun博士解释了他选择Hamilton系统实现工作流程自动化的决定： “在加入AJCH 之前，我曾在费城儿童医院使用过Hamilton仪器。Hamilton仪器的技术特点和可靠性都非常出色，因此当我们开始在AJCH的基因组学部门实现工作流程自动化时，Hamilton是我们很好的选择。

基因组学CoE目前有两个Hamilton Microlab®NGS STAR，其中五个工作流程已经自动化。这些工作流程包括基因分型、DNA稀释和WES和rWGS文库制备。严格的验证过程正在进行中或已经完成，以确保其适用于诊断目的。在本案例研究中，我们重点关注用于小猎鹰项目测试的rWGS库准备工作流程的自动化。

rWGS文库制备自动化工作流程

小猎鹰项目 rWGS 的整个过程包括七个阶段：(1) 样品采集；(2) DNA 提取；(3) WGS 文库制备；(4) 定量和汇集；(5) 测序；(6) 分析；(7) 结果交付。

El Naofal女士更详细地描述了这一过程： “首先用EDTA管采集外周血样本（受试者和父母），然后用QIAGEN QIAsymphony 仪器提取基因组DNA。提取gDNA后，将其与文库制备所需的耗材和试剂一起摆放到Hamilton Microlab®NGS STAR的台面上。制备好的NGS文库使用赛默飞世尔科技公司的Qubit 4.0荧光仪检测文库的浓度，而后在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。测序结束后，生物信息学团队会立即对结果进行内部分析，并在样本采集后48到72小时内将结果告知患者。 这种方法之所以被称为“快速"，是因为从样本采集到结果通报的时间很短。

系统描述

用于 rWGS 文库制备的系统是基于Hamilton Microlab® NGS STAR，该系统有八个 1000 μL移液通道、一个 CO-RE® 抓手工具、一个磁力架、五个Hamilton加热振动器（HHS）和两个用于控温孵育的 INHECO CPAC。

自动化流程描述

如前所述，rWGS文库制备方法基于Illumina的DNA PCR自由文库制备试剂盒在Hamilton液体处理器上的自动化（第3阶段）。自动化工作流程包括四个主要步骤。

1.     Tagmentation of the Genomic DNA

2.     Post-Tagmentation Clean-up 

3.     Index Ligation 

4.     Post-index Library Clean-up

Hamilton Microlab® NGS STAR可自动处理这四个步骤。Hamilton实验室自动化顾问Murad Sharabati先生进一步描述：“NGS STAR上的这种方法非常简单，用户友好。NGS STAR中的自动条形码阅读器可读取试剂盒中管的条码信息，并将信息输入VENUS软件。用户只需手动将一些耗材（如无核酸酶的水）摆放到平台上的50毫升槽中。对于步骤1 (tagmentation) 和3 (index ligation)，通过使用Hamilton 加热振荡器实现孵育步骤。因该步骤不需要温度变化，因此无需使用台面热循环仪 (ODTC)，从而降低了总体成本。此外，HHS还用于某些步骤中的混合，减少了所需的耗材量和处理时间。纯化（步骤2和4）依赖于台面上的磁力架。为了在这些步骤中最大限度地确保样品的均一性，我们设计了一个批处理程序。该程序利用8个1000 µL 移液通道串联处理3个批次，然后继续处理后面的3个批次，依此类推。这样既缩短了处理时间，又保证了结果的一致性和准确性"。完成这四个自动化 NGS 文库制备核心工作流程步骤后，文库将进行人工定量和汇集。Hamilton基因组学高级细分市场负责人Birgit Ottenwälder博士对这些额外工作流程步骤的潜在自动化发表了评论：如果需要，定量和汇集步骤也可以使用Hamilton的NGS STAR进行自动化。特别是定量步骤，可通过第三方设备整合或通过Hamilton用于荧光检测的新型台面模块FLUOREYE实现自动化。定量和汇集步骤通常是为满足客户的个性化要求和实验室设置而定制的。因此，这些步骤可根据要求添加到我们经 Hamilton验证或合作伙伴认证的NGS文库制备核心方法中。

WGS文库制备自动化的优势

准确性和可重复性 

自动化可大幅降低错误率，这得益于工作流程的标准化以及消除了操作员引起的变化和偶然错误。液体处理技术的精确性和准确性可确保减少在错误处理和潜在重复上浪费的时间，从而全面提高诊断速度。基因组学CoE目前正在对用于诊断的自动化工作流程进行全面验证（超出了小猎鹰项目的临床研究目的）。初步结果表明，所有质量标准都与人工处理的质量标准相似或更好。图4显示，在自动化处理过程中，所有测试样本的基因组覆盖率均超过90%。

无人值守时间

自动化的主要优势之一是能让科学家大大减少 “动手时间"，这在NGS文库制备等长时间工作流程中尤为有用。使用手动方法，24个样本需要3到4个小时的动手工作，而使用Hamilton系统，只需要30到45分钟的动手时间。

通量

自动化工作流程允许同时运行多达96个样本。尽管小猎鹰项目的目标是在两年内对600个样本进行测序，但其目的是将这一自动化工作流程添加到医院的标准遗传学服务列表中。AJCH的基因组学CoE预计每月运行100至150个样本。

灵活性

来自不同供应商的多种方法可在同一Hamilton NGS STAR工作站上实施，在这些方法之间切换只需交换几个载架。对于运行多种方法/测定的客户来说，将Hamilton自动化系统用于各种用途的能力尤其具有吸引力。