将细胞培养标准化提升一个新高度

引言

目前，细胞培养操作中持续存在的质量和可重复性问题仍是重大挑战，导致生物学和生物医学研究中时间和宝贵资源的浪费。自动化通过显著提升可追溯性、标准化并减少人为错误，有效降低了当前可重复性危机背后的风险。Hamilton Cell Care STAR专为标准化的细胞维护工作流程而设计，确保细胞在每周的每一天都能以相同且可重复的方式进行处理。实验数据和记录通过Cell Control软件进行报告；该软件提供用户友好的界面，并在后台管理多种不同的细胞培养应用。在此，我们展示了基于Cell Control软件两种工作流程（工作步骤）的细胞培养自动化优势：“扩增"和“接种"。通过多种可调节参数，这些操作步骤使用户能够将单个24孔培养板中的细胞扩增到多个24孔目标板中，或将其接种到96孔板中以设置实验。

与手动操作相比，自动化细胞接种和扩增在24孔板和96孔板格式中均显著降低了孔间变异性。标准化方法（“工作步骤"）和参数可调整且可追溯，确保实验的一致性。用户友好的Cell Control软件只需点击几下即可进行调度，并提供可靠的时间和资源管理，将用户干预降低。

24孔板扩增

图：24孔板扩增工作流程。将24孔培养板中的细胞脱落并转移至多个（2-20个）24孔目标板中，转移比例由用户自定义，随后进行全自动成像和数据分析。

24孔板接种

图：24孔板接种工作流程。将24孔培养板中的细胞脱落并转移至多个（2-20）96孔目标板中，其中24孔板的1个孔对应96孔目标板的4个孔。使用用户定义量的细胞悬液进行接种，随后进行全自动成像和数据分析。

向自动化细胞培养系统过渡不仅仅意味着优化细胞自动化工作流程——Cell Care STAR确保了高度的一致性和自主性，从而将细胞培养标准化提升到了一个新的水平。

HeLa细胞（Sigma-Aldrich，93021013）在标准组织培养条件下在补充有10%FBS（Gibco，A5256801）的高糖DMEM（Gibco）（L0101-500）中培养。实验前一天，使用Cell Care STAR工作步骤“从槽中接种"将细胞接种到条形码的24孔板（Greiner，662160）中，并使用Cytation 1成像仪和Gen5软件（安捷伦）的细胞分析工具确定细胞融合。仅选择细胞融合为60%至80%的培养板用于实验。整个“扩增"和“接种"过程在Cell Care STAR系统上自动完成，而为了进行比较评估，该过程由一位经验丰富的操作员手动完成。HeLa细胞用PBS（Fisher Scientific，153736631）洗涤一次，然后在+37°C下用0.05%胰蛋白酶-EDTA（Fisher Sciences，25300104）分离4分钟，然后在1000 rpm下振荡2分钟。胰蛋白酶用两倍体积的培养基中和，细胞悬浮液通过移液混合。对于细胞扩增，将一个24孔板中的细胞转移到五个24孔板中，分装比例为1:5。在细胞接种时，将50μL细胞悬液转移到每个孔中，共使用三个96孔板（Thermo Fisher,181736）。手动操作时使用多通道移液器，条件与上述相同。

Cell Control 软件

Hamilton Cell Control软件是专门为在几天或几周内自主管理复杂的细胞培养维护工作流程而开发的。其直观易用的界面支持通过简单点击即可完成批次设置（包含多个操作步骤）、试剂补给以及消耗量估算等功能。每个工作步骤均包含一组可调整的参数（例如胰蛋白酶孵育时间、传代比例、培养基体积等），可根据不同细胞系的特性进行精细调整。

图:Hamilton Cell Control软件的概述选项卡，突出显示了其主要功能。

图：Hamilton Cell Control软件的批次概述界面。每个批次的工作步骤均可单独安排，且每个步骤均包含一组可调整的参数。

技术

Cell Care STAR配备二级生物安全柜，确保样本、人员及环境的安全。其集成的细胞培养箱、培养板储存系统及温度可控的台面储存空间（例如+10至+40°C）可存储试剂和培养板，提供自主操作。该设备配备两个倾斜模块和两个加热震荡器，可同时处理两个细胞培养板。细胞脱落过程可定制，使细胞传代操作能够适应不同细胞系的需求。集成的Agilent Cytation 1 Reader和Gen5软件允许设置用户定义的分析方法，用于基于细胞的检测和生长监测。通过 Hamilton Cell Control软件，可轻松安排工作流程，该软件提供用户友好的界面，实现快速高效的流程规划。该软件内置11种预先编程、测试并验证的即用型方法，适用于6孔、24孔和96孔板格式。Cell Care STAR使用户能够以自动化、可追溯和可调节的方式进行一般的细胞培养维护和准备大规模实验（例如基于细胞的检测），并且具有非常高的标准化水平。使用AutoStart功能，可以最大限度地延长无人值守时间，使周末工作变得不必要。

结果

将HeLa细胞扩增到五个24孔板中或接种到三个96孔板上，并使用来自不同传代的细胞在三个生物复制品中测量细胞融合度。为了评估重复性，计算了同一培养板内不同孔位之间细胞融合度的变异系数（CV），以及不同培养板之间平均细胞融合度的变异系数（CV）。Cell Care STAR系统进行的自动化细胞培养操作与经验丰富的操作员进行的手动处理相比，在将细胞扩增至24孔板（p<0.05）和接种至96孔板（p<0.001）时，孔间变异性显著降低。目标板之间平均细胞融合的CV值相当，且在自动化操作与手动操作之间无显著差异。

扩增：从24孔扩增至5×24孔

图：将24孔板中的HeLa细胞转移至五块24孔板中，其中两块使用Cell Care STAR（上）转移，另三块由用户手动转移（下），并在24小时后进行成像（A）。图中显示了细胞培养板内各孔之间细胞融合度的变异系数（B）以及三组生物重复（n=3）中各板之间平均细胞融合度的变异系数（C）。***表示在采用非配对学生t检验的组间比较中，p<0.001具有统计学意义。

接种：24孔板至3×96孔板

图：将24孔板中的HeLa细胞转移至三个96孔板中，其中一部分使用Cell Care STAR（上）转移，另一部分由用户手动转移（下），并在24小时后进行成像（A）。图中显示了细胞培养板内各孔之间细胞融合度的变异系数（B）以及三份生物重复实验中各板之间平均细胞融合度的变异系数（C）（n=3）。*表示采用非配对学生t检验后，组间差异具有统计学意义（p<0.05）。

讨论/总结

基于细胞的实验在制药和生物医学研究中的使用正在迅速扩大，对细胞培养标准化、数据质量和更高通量的改进需求也在增加。Hamilton的Cell Care STAR是即用型解决方案，旨在通过优化许多常见的细胞培养维护工作流程来满足这些需求。通过利用Cell Care STAR的“扩增"和“接种"工作步骤，我们证明了自动化能够显著提升细胞接种的准确性，与经验丰富的研究人员的手动操作相比，自动化可减少培养板内孔间变异性。通过自动化实现数据质量的提升，是通过精准的液体处理技术，结合关键细胞处理步骤（如移液速度、细胞混合周期、胰蛋白酶孵育时间、细胞脱落以及细胞在培养箱外停留时间）执行过程中的低变异性共同实现的。此外，Cell Control软件可实现对所有细胞操作步骤的自动追踪，从而几乎杜绝实验或样本混淆的可能。此外，该软件还支持在最佳时间点规划并执行细胞维护步骤、细胞实验设置以及细胞检测，且全程无需人工干预——无需实验人员在场即可完成操作，确保实验在需要时而非仅在方便时执行。Cell Care STAR 能够处理约20个细胞培养板，将约8个细胞培养板扩增至40个，并能够从8个细胞培养板中无需人工干预地接种80个96孔板，具体取决于体积设置和细胞培养板格式。Cell Care STAR的日程安排按照优先级顺序并根据用户的决定在日程安排的当天执行工作步骤。